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A
CAP
A
C
I
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TE Y CONTEN
I
D
O
FENÓLICO D
EL AC
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E
ESE
N
C
I
A
L DE
H
OJAS SECAS Y
H
ÚMED
A
S
D
E
GUAVI
D
U
C
A (Pi
pe
r
carpuny
a Ruiz & Pa
v.)
En
r
íquez
Es
tr
e
lla
,
M
ig
u
el
1
@
RESUMEN. El presente estudio evaluó la capacidad antioxidante y contenido de compuestos fenólicos
de la hoja cruda y seca de la Guaviduca (Piper carpunya Ruiz & Pav.), siendo la capacidad
antioxidante determinada por el método FRAP (Ferric ion reducing antioxidant Power) y ABTS (Ácido
2,2 –azinobis (3etilbenzotiazolin)6sulfónico), y el contenido de compuestos fenólicos totales usando
el método FolinCiocalteau, como resultado evidenciamos que existe una elevada actividad fenólica
en aceites esencial obtenido de las hojas húmedas así como la actividad antioxidante total por el
método FRAP y ABTS. En conclusión, determinamos que la capacidad antioxidante obtenida por los
2 métodos FRAP Y ABTS esta correlacionada con el contenido de fenoles totales.
PALABRAS CLAVE: Tropical; bioactivos; flavonoides; comunidades; Amazonia;
A
BSTRACT. Evaluation of the antioxidant capacity and phenolic content of the essential oil of
dry and humid leaves of Guaviduca (Piper carpunya Ruiz & Pav.). The present study evaluated
the antioxidant capacity and content of phenolic compounds of the raw and dry leaf of Guaviduca
(Piper carpunya Ruiz & Pav.), being the antioxidant capacity determined by the FRAP method (Ferric
ion reducing antioxidant Power) and ABTS (Acid 2,2 –Azinobis (3ethylbenzothiazolin) 6sulfonic),
and the content of total phenolic compounds using the FolinCiocalteau method, as a result we show
that there is a high phenolic activity in essential oils obtained from wet leaves as well as the total
antioxidant activity by the FRAP and ABTS method. In conclusion, we determined that the antioxidant
capacity obtained by the 2 methods FRAP and ABTS is correlated with the content of total phenols.
K
EY WORDS: Tropical; bioactive; flavonoids; communities; Amazonia;
SEMIÁRIDA Revista de la Facultad de Agronomía UNLPam Vol 31(1), 0915.
6300 Santa Rosa  Argentina. 2021. ISSN 24084077 (online)
DOI: http://dx.doi.org/10.19137/semiarida.2021(01).0915
Recibido: 25/05/2020
Aceptado: 8/10/2020
Cómo citar este trabajo:
EnríquezEstrella, M. (2021). Evaluación de la capacidad
antioxidante y contenido fenólico del aceite esencial de
hojas secas y húmedas de Guaviduca (Piper carpunya Ruiz
& Pav.). Semiárida, 31(1), 0915.
INTRODUCCIÓN
Numerosos estudios en nutrición humana,
demuestran una estrecha correlación entre el
consumo de frutas y verduras y la menor
incidencia de enfermedades crónico
degenerativas, debido a su bajo contenido en
colesterol y a la presencia de vitaminas, fibras,
antioxidantes naturales y minerales (Murillo,
2002). Los compuestos fenólicos son
metabolitos esenciales para el crecimiento y
reproducción de las plantas y actúan como
agentes protectores frente a patógenos, siendo
secretados como mecanismo de defensa a
condiciones de estrés, tales como infecciones,
radiaciones UV, entre otros, esta síntesis se da a
partir de fenilalanina por la vía del shikimato.
Juegan un rol vital en las plantas y regulan el
metabolismo y síntesis de la lignina (Dixon &
Paiva, 1995). Los compuestos fenólicos son un
gran grupo de antioxidantes naturales; consumo
de fuentes importantes, particularmente de
frutas, vegetales y cereales presentan efectos
benéficos (Naczk & Shahidi, 2006)
Los principales fenoles presentes en las hojas
de té son los flavonoides, dentro de los cuales
las catequinas constituyen hasta un 30 % de la
materia seca. Dependiendo de la configuración
estereoquímica del 3´,4´ dihidroxifenil y de los
grupos hidroxilos en la posición 2 y 3 del anillo
C, las catequinas del té se encuentran formando
2 isómeros: transcatequinas y cisepicatequinas.
1
Universidad Estatal Amazónica. Facultad de Ciencias de la Tierra. Puyo, Ecuador.
@ menriquez@uea.edu.ec
10
Cada uno de estos a su vez poseen dos isómeros
ópticos: (+) catequina y (–)catequina, (–)
epicatequina y (+)epicatequina, respectiva
mente. La (– )catequina puede ser modificada
por medio de una esterificación con ácido gálico
para formar (–)catequina3galato, (–)
epicatequina3galato, (–)epigalocatequina3
galato y (– )galocatequina3galato (Friedman
et al., 2005).
La Guaviduca crece en las comunidades
cercanas a bosques tropicales de la región
amazónica con una altura que oscila entre 500 a
100 msnm y en la región subtropical colindante
entre la región sierra y costa entre los 500 a 1500
msnm, es utilizada para infusiones por los
compuestos bioactivos que posee para
problemas gastrointestinales y como aderezo y
potenciador de sabor en la gastronomía de la
zona (Enríquez, 2019).
La metodología más reconocida y aplicada
para la determinación del contenido total de
polifenoles es el ensayo de FolinCiocalteau
(Proestos & Varzakas, 2017). Existen otras
técnicas para la determinación actividad
antioxidante total, entre estas se encuentran el
método FRAP (Ferric ion reducing antioxidant
Power) reportado por Benzi y Strain (1996) y el
ABTS (ácido 2,2 –azinobis (3
etilbenzotiazolin)6sulfónico) informado por
Re et al. (1999).
Actualmente, en la región amazónica del
Ecuador se ha iniciado
investigaciones sobre las
propiedades funcionales de
algunas especies vegetales. Sin
embargo, no se aplicado en la
industria de alimentos en la zona.
Por tanto, el grupo de
investigación de antioxidantes de
la Facultad de Ciencias de la
Tierra a emprendido el proceso
de utilización de estos
componentes en una primera
fase, en el área de cárnicos
(chorizos), por lo que es
primordial conocer las
características que presenta cada
especie vegetal
El objetivo de la investigación
fue la evaluación de la capacidad antioxidante y
el contenido fenólico, de la Guaviduca a partir
del aceite esencial extraído de hojas secas y
húmedas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización
La investigación se llevó a cabo en los
laboratorios de Química y Biología de la
Universidad Estatal Amazónica, ubicada en el
Km 2 ½ de la vía Puyo a Tena, paso lateral.
Tipo de Investigación
Es una investigación tipo aplicada, la cual se
fundamenta en la experimentación. Se
emplearon métodos cuantitativos que
permitieron controlar las variables
independientes, se realizaron cálculos numéricos
y análisis estadísticos para establecer modelos
de comportamiento.
Materiales
La especie vegetal fue recolectada en la zona
tropical de la provincia de Chimborazo, a 1200
msm, mas específicamente en el canton
Pallatanga (Figura 1).
Métodos
Recolección
Se seleccionaron hojas simples, alternas y
dísticas, de color verde oscuro en el haz y verde
más pálido en el envés, lanceoladas hasta
elípticas, el ápice acuminado; base aguda,
EnríquezEstrella, M.
Figura 1. Ubicación geográfica del Cantón Pallatanga.
Figure 1. Geographic location of Canton Pallatanga.
SEMIÁRIDA Vol. 31, N° 1. EneroJunio 2021. ISSN 24084077 (online), pp. 0915
Evaluación de la capacidad antioxidante y contenido fenólico del aceite esencial de hojas secas y húmedas de Guaviduca (Piper
carpunya Ruiz & Pav.)
11
predominantemente inequilátera, las láminas
coriáceas, glabras, de 9  14 cm de longitud y 4
7 cm de ancho; nervios secundarios 2 3 pares,
pinnados, oblicuos; en la mitad basal que
ascienden hasta el ápice, y la mitad apical de la
hoja posee 5 6 pares de nervios cortos, no
ascendentes; los 2 3 pares basales forman un
ángulo de 70° con respecto al nervio principal,
los nervios terciarios moderadamente
reticulados; peciolo de 8 10 mm de longitud,
glabro, vaginado en la base. La recolección de
la hoja se realiza a partir de los 365 días de vida
de la planta.
Deshidratado
Para la obtención del follaje seco de la
muestra se realizó un deshidratado a 65 °C por
cinco horas.
Extracción de aceite esencial
Para la obtención del aceite esencial se utilizó
el método de destilación por arrastre de vapor
de agua, se lleva a cabo una vaporización
selectiva del componente volátil, por medio de
la inyección de vapor de agua directamente en
el seno de la mezcla.
Extracción de principios activos
El material vegetal fue lavado con agua
potable, secado en estufa (Barnstead
International, EEUU) con recirculación de aire
a una temperatura de 45 °C, pulverizado en
molino de cuchillas (Thomas Scientific, EEUU)
y luego tamizado, con el objetivo de garantizar
un tamaño de partícula inferior a 0,5 mm,
considerado adecuado para la posterior
obtención de los extractos (Azwanida, 2015; Ph.
Eur., 2017). El extracto de Guaviduca se realizó
con el método de Extracción Asistida por
Ultrasonido (Ultrasound Assisted Extraction –
UAE) (Branson Ultrasonics, EEUU). Para la
extracción se utilizó una mezcla etanol: agua en
proporción 9:1, con una relación de 250 mL de
disolvente por cada 50 g de muestra
pulverizada. Las extracciones fueron realizadas
por triplicado. Se trabajó a 35 °C durante una
hora y posteriormente la mezcla fue filtrada a
través de un filtro de Gooch y el extracto crudo
obtenido fue concentrado con evaporador
rotatorio (Büchi, Alemania) a temperatura de 45
°C y presión reducida de 600 mmHg hasta un
volumen final de 50 mL.
Métodos de análisis
1. Determinación de compuestos fenólicos
1.1. Fenoles totales
La determinación de fenoles se realizó por el
método colorimétrico de FollinCiocalteu
diseñado por Singleton et al., 1965, 50 uL de
muestra fueron adicionados a 125 uL del
reactivo de Folin, y 400 uL de carbonato de
Sodio 7,1 % (p/v), ajustando con agua destilada
hasta 1000 uL, se realizó la lectura espectrofoto
métrica a 760 nm y se comparó con la curva
patrón usando como estándar ácido gálico
(fenol). Los resultados fueron expresados como
mg de Ácido gálico Equivalente / 100 g de
muestra.
1.2. Flavonoides
La determinación de flavonoides se realizó
siguiendo el método colorimétrico diseñado por
Marinova et al. (2005) con algunas
modificaciones. 100 uL de muestra fueron
mezclados con 30 uL de NaNO
2
al 5 % (p/v), 30
uL de AlCl
3
10 % (p/v), 200 uL de NaOH a 1M
y ajustados con agua destilada hasta un volumen
final de 1000 uL, se realizó la lectura
espectrofotométrica a 510 nm y se comparó con
la curva patrón usando como estándar (+)
catequina. Los resultados fueron expresados
como mg de Catequina Equivalente / 100 g de
muestra.
1.3. Taninos condensados
Este método colorimétrico se fundamenta en
la reacción de los taninos condensados con
vainillina bajo condiciones ácidas como lo
diseñó Hagerman et al. (1989): 230 uL de
muestra fueron adicionados a 670 uL de una
solución de vainillina recién preparada (1 g/100
ml) en ácido sulfúrico al 70 %. La mezcla se
incubó a 20 °C durante 15 min y se realizó la
lectura espectrofotométrica a 500 nm y se
comparó con la curva patrón usando como
estándar (+)catequina. Los resultados fueron
expresados como mg de Catequina Equivalente
/ 100 g de muestra.
1.4. Ácidos Fenólicos
Ácido elágico, ácido clorogénico y ácido p
Coumárico. El contenido de ácido elágico, ácido
SEMIÁRIDA, Vol. 31, N° 1. EneroJunio 2021. ISSN 24084077 (online), pp. 0915
clorogénico y ácido pCoumárico para la
muestra, se determinó mediante análisis por
HPLC, según el protocolo modificado de
Kelebek et al. (2009). El extracto acuoso se filtró
(tamaño de poro 0,45 m) y se hicieron diluciones
en agua suprapura, antes de la inyección al
cromatógrafo.
Para la implementación del ensayo de Folin
Ciocalteu (Proestos & Varzakas, 2017),
previamente se construyó una curva de
calibración haciendo diluciones sucesivas a
partir de una disolución concentrada de 1000
mg.L
1
de ácido gálico (estándar de referencia,
tabla 1). A partir de esta disolución se prepararon
10 ml de cada una de las disoluciones diluidas
de concentraciones crecientes de ácido gálico
entre 5 y 25 mg.L
1
. Para la determinación se
tomaron 40 μl de la muestra en un matraz
aforado de 10 ml y se añadieron 500 μl de
reactivo Folin Ciocalteu. Se dejó en reposo
EnríquezEstrella, M.
protegido de la luz por 10 minutos. Una vez
terminado este tiempo, se añaden 500 μl de
disolución de carbonato de sodio al 10 %, se
completó el volumen a 10 ml con agua destilada
Se homogeneizó y se mantuvo en oscuridad por
2 horas, para finalizar con la medida de la
absorbancia a 765 nm contra blanco de
reactivos.
Determinación de actividad antioxidante
Método FRAP (Ferric ion reducing
antioxidant Power): En este método se mide la
reducción de 2,4,6Tripiridiltriazina Férrica
(TPTZ) a un producto coloreado por la actividad
de compuestos antioxidantes (Benzi y Strain,
1996).
Para esta determinación se tomaron 80 μl de
la muestra en un matraz aforado de 10 ml y se
añadieron 5 mL de disolución de FRAP, se aforó
con agua destilada. Se deja reposar, en una
estufa a 37 ºC, por 30 minutos y se lee la
absorbancia a una longitud de onda de 593 nm
contra blanco.
Para esta determinación se añadieron, en un
matraz de 10 mL, 80 µL de muestra, y 5 mL de
disolución de FRAP. Se dejó reposar, en una
cámara oscura a 37 °C, por 30 minutos. Para
finalmente medir la absorbancia a una longitud
de onda de 593 nm contra blanco.
Método ABTS (Ácido 2,2 –azinobis (3
etilbenzotiazolin)6sulfónico): Este se
fundamenta en la capacidad de un antioxidante
para estabilizar el radical catión coloreado
12
Componentes añadidos
Concentración de ácido
gálico (mg.L
1
)
5 10 15 20 25
Ácido gálico (uL) 50 100 150 200 250
Reactivo FolinCiocalteau
(uL)
500 500 500 500 500
Disolución de carbonato
de sodio 10 % (uL)
500 500 500 500 500
T
abla 1. Determinación de fenoles totales, curva patrón
de ácido gálico a partir de una solución concentrada de1
000 mg.L
1
. Volumen final 10 mL (agua destilada).
Fuente: Enríquez M. (2020)
Table 1. Determination of total phenols, gallic acid
standard curve from a concentrated solution of 1000
mg.L
1
. Final volume 10 mL (distilled water). Source:
Enríquez M. (2020)
Componentes
añadidos
Concentración de ácido
gálico (mg.L
1
)
5 10 15 20 25
Ácido gálico (uL) 10 20 25 30 35
Disolución FRAP (mL) 5 5 5 5 5
Tabla 2. Preparación de la curva patrón de trolox a
partir de una disolución concentrada de 1 000 mg.L
1
.
Volumen final 10 mL (agua destilada). Fuente: Enríquez
M. (2020)
Table 2. Preparation of the standard trolox curve from
a concentrated solution of 1 000 mg.L
1
. Final volume
10 mL (distilled water).
Source: Enríquez M. (2020)
Componentes
añadidos
Concentración de ácido
gálico (mg.L
1
)
5 10 15 20 25
Ácido gálico (uL) 20 30 40 50 60
Radical ABTS (mL) 2 2 2 2 2
Tabla 3. Preparación de la curva patrón de trolox a
partir de una disolución concentrada de 1 000 mg.L
1
.
Volumen final 10 mL (agua destilada). Fuente: Enríquez
M. (2020)
Table 3. Preparation of the trolox standard curve from
a concentrated solution of 1 000 mg.L
1
. Final volume
10 mL (distilled water). Source: Enríquez M. (2020)
SEMIÁRIDA, Vol 31, N° 1. EneroJunio 2021. ISSN 24084077 (online), pp. 0915
Evaluación de la capacidad antioxidante y contenido fenólico del aceite esencial de hojas secas y húmedas de Guaviduca (Piper
carpunya Ruiz & Pav.)
ABTS•, el cual es formado previamente por la
oxidación del ABTS (2,2 ́ azinobis (3
etilbenzotiazolina6 ácido sulfónico)) por
metamioglobina y peróxido de hidrógeno. Los
resultados son expresados como equivalentes de
Trolox (Re et al., 1999).
Fue construida una curva de calibración
haciendo diluciones sucesivas a partir de una
disolución concentrada de 1000 mg.L
1
de ácido
gálico (Tabla 3). A partir de esta disolución se
prepararon 10 ml de cada una de las disoluciones
diluidas de concentraciones crecientes de ácido
gálico entre 5 y 25 mg.L
1
.
Para esta determinación se tomaron 40 µL de la
muestra y se colocaron en la cubeta del
espectrofotómetro. Se adicionaron 2 mL de la
disolución del radical y se esperaron 7 minutos.
Se realizó la lectura de absorbancia a una longitud
de onda de 730 nm contra un blanco de etanol.
Análisis Estadístico
El experimento se condujo de acuerdo a dos
factores (variables) el estado de la hoja y las
técnicas de análisis.
Se obtuvieron un total de seis tratamientos
con la variable de salida polifenoles totales y
actividad antioxidante. Las técnicas de análisis
usadas son anova y prueba de Tukey, con la
determinación de intervalos de confianza para la
media de la población.
Técnicas de análisis: Todos los análisis se
hicieron con la aplicación del programa
estadístico Infostat versión 1.0 para Windows
(Di Rienzo et al., 2017).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la tabla 4 se muestran los resultados de
actividad polifenólica por el método Folin
Ciocalteau y la actividad antioxidante totales
estimadas según los métodos de FRAP y ABTS.
Se observaron valores mayores, en todas las
determinaciones, del aceite esencial obtenido de
las muestras húmedas de las hojas de
Guaviduca. Este comportamiento puede deberse
a la degradación de los compuestos activos con
actividad antioxidante y a la pérdida de aceites
esenciales por el proceso de evaporación durante
el secado.
En la tabla 4 se observa que el Folin extraido
a partir de la hoja humeda tiene diferencia
significativa en relación a los demás métodos.
La diferencia significativa entre métodos
(seco y húmedo, Tabla 5) se debe a la
degradación de las plantas al momento de
secado así como la humedad relativa del
ambiente en el que se realiza los ensayos
(Enríquez et al., 2018). Cerca del 20 % de las
plantas del Ecuador se han utilizado en estudios
farmacéuticos, lo que ha tenido un impacto
positivo en el sistema de salud, como el
tratamiento del cáncer y otras enfermedades
nocivas (Naczk & Shahidi, 2006). Las plantas
generan diversos compuestos bioactivos entre
ellos polifenoles. Las altas concentraciones de
fotoquímicos, que pueden proteger contra el
daño de los radicales libres, se acumulan en
frutas, verduras y plantas en general (Suffredini
et al., 2004). Las plantas que contienen
fotoquímicos beneficiosos pueden
13
Muestras
Métodos (mg.L
1
)
Folin
Ciocalteau
FRAP ABTS
Hoja verde 23,72 13,26 0,31
Hoja seca 19,34 9,1 0,13
Tabla 4. Actividad fenólica total según FoliCiocalteau y
actividad antioxidante total por FRAP y ABTS a aceites
esenciales de Guaviduca (Piper carpunya L) en muestras
húmedas y secas.
Table 4. Total phenolic activity according to Foli
Ciocalteau and total antioxidant activity by FRAP and
ABTS to essential oils of Guaviduca (Piper carpunya L) in
wet and dry samples.
Tratamientos N
Subconjunto para alfa = 0,05
1 2 3 4 5
ABTS seca 6 0,1267
ABTS húmeda 6 0,314
Frap seca 6 9,1035
Frap húmeda 6 13,2698
Folin seca 6 19,3372
Folin húmeda 6 23,7246
Sig. 0,979 1 1 1 1
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos
homogéneos.
a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 6,000.
Tabla 5. Evaluación estadística Test de Tukey.
Table 5. Statistical evaluation Tukey Test.
SEMIÁRIDA, Vol 31, N° 1. EneroJunio 2021. ISSN 24084077 (online), pp. 0915
14
presencia de fenoles y flavonoides, se convierte
en un aditivo natural que se incluiría en
productos alimenticios para darle una
funcionalidad y también como una alternativa
para calmar dolores gastrointestinales.
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14
EnríquezEstrella, M.
complementar las necesidades del cuerpo
humano actuando como antioxidantes naturales
(Boots et al., 2008). Compuestos fenólicos como
flavonoides, taninos y ligninas, que se
encuentran en las plantas, actúan como
antioxidantes con eficacia (Suffredini et al.,
2004). El consumo de frutas y verduras se ha
relacionado con varios beneficios para la salud,
como resultado de propiedades medicinales y
alto valor nutricional (Valko et al., 2006). Los
antioxidantes controlan y reducen el daño
oxidativo en los alimentos al retrasar o inhibir la
oxidación causada por las especies reactivas de
oxígeno, lo que en última instancia aumenta la
vida útil y la calidad de estos alimentos (Ames
et al., 1993). El betacaroteno, el ácido ascórbico
y muchos compuestos fenólicos desempeñan
papeles dinámicos para retrasar el
envejecimiento, reducir la inflamación y
prevenir ciertos cánceres (Duthie et al., 1996).
La actividad antioxidante de una especie
vegetal es la expresión de los diferentes
componentes poli fenólicos, los cuales emplean
diferentes mecanismos de acción para
neutralizar las especies reactivas de oxígeno.
(Zulueta et al., 2009).
Los contenidos poli fenólicos fueron mayores
en relación al FRAP y ABTS, la diferencia
sugiere que los compuestos antioxidantes
presentes en las fracciones liquidas evaluadas
son altamente hidrofilias y estas son más
sensibles a la técnica ABTS. El valor ABTS en
el extracto acuoso fue menor al reportado por el
poder reductor del método FRAP.
CONCLUSIONES
La abundancia de las especies vegetales en el
Ecuador, nos brinda la oportunidad de realizar
estudios de compuestos bioactivos, en relación
al aceite esencial de hojas secas y húmedas,
revelo que los contenidos fenlicos y la actividad
antioxidante de la especie vegetal tiene mejor
rendimiento cuando se realiza con el aceite
extraido de hojas secas, generando mejores
resultados en la absorción del cuerpo humano de
contenidos fitoquimicos, que ayudan al
desarrollo metabolico.
La (Piper carpunya Ruiz & Pav.) al presentar
una capacidad captadora de radicales libres, por
SEMIÁRIDA, Vol 31, N° 1. EneroJunio 2021. ISSN 24084077 (online), pp. 0915
Evaluación de la capacidad antioxidante y contenido fenólico del aceite esencial de hojas secas y húmedas de Guaviduca (Piper
carpunya Ruiz & Pav.)
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